L'enzyme : structure, spécificité et cinétique en prépa

Ce qu'est une enzyme : un catalyseur de nature biologique

Une définition en trois éléments

Retiens trois éléments dans la définition. Une enzyme est produite par un être vivant, elle catalyse une réaction, et elle se retrouve intacte à la fin de cette réaction. Ces trois points la distinguent d'un réactif ordinaire. Ils la distinguent aussi d'un catalyseur minéral comme le platine, qui n'est pas d'origine biologique.

Régénérée après chaque cycle, une enzyme traite un très grand nombre de molécules de substrat.

Des protéines, mais pas seulement

La très grande majorité des enzymes connues sont des protéines. Leur chaîne polypeptidique se replie en une structure tridimensionnelle précise, dont dépend toute leur activité. Cette nature protéique a longtemps été considérée comme une caractéristique obligatoire de la catalyse biologique. Le premier cristal d'enzyme, celui de l'uréase, a été obtenu par James Sumner en 1926.

Les travaux de Thomas Cech et de Sidney Altman ont modifié ce cadre. Ils ont montré que certaines molécules d'ARN catalysent elles aussi des réactions chimiques. Ces ARN catalytiques sont appelés ribozymes. Leurs auteurs ont reçu le prix Nobel de chimie en 1989 pour cette découverte.

Le vocabulaire à fixer tout de suite

Le substrat est la molécule transformée par l'enzyme. Le produit est la molécule issue de cette transformation. Le complexe enzyme-substrat, noté ES, est l'association transitoire des deux pendant la réaction. Une enzyme qui agit sur le saccharose s'appelle une saccharase, par exemple, selon la règle du suffixe en « ase ».

L'activité enzymatique, elle, se mesure en vitesse de disparition du substrat ou de formation du produit.

Ce que l'enzyme ne fait pas

Ce point est essentiel, et il est très souvent sanctionné en copie. Une enzyme ne déplace pas l'équilibre de la réaction qu'elle catalyse. Elle ne rend pas spontanée une réaction qui ne l'était pas. Elle ne modifie ni l'enthalpie libre de réaction ΔrG, ni la constante d'équilibre K.

Ce qu'elle modifie, c'est la vitesse à laquelle l'équilibre est atteint. Une réaction thermodynamiquement favorable mais infiniment lente devient rapide en présence de l'enzyme adaptée. L'enzyme accélère aussi bien le sens direct que le sens inverse. Elle agit donc sur la cinétique, jamais sur la thermodynamique.

Catalyse, énergie d'activation et structure du site actif

L'abaissement de l'énergie d'activation

Pour qu'une réaction se produise, les réactifs doivent franchir une barrière énergétique. Cette barrière correspond à l'état de transition, et sa hauteur est l'énergie d'activation, notée Ea. Plus Ea est élevée, plus la fraction de molécules capables de la franchir est faible, et plus la réaction est lente.

v = A × exp(−Ea / (R × T))

Dans cette relation d'Arrhenius, v est la vitesse de la réaction et A un facteur préexponentiel homogène à une vitesse. Ea est l'énergie d'activation en J·mol⁻¹, R la constante des gaz parfaits égale à 8,314 J·K⁻¹·mol⁻¹, et T la température absolue en kelvins. L'enzyme diminue Ea, donc augmente v. Elle stabilise l'état de transition par des interactions avec le substrat, ce qui rend le chemin réactionnel moins coûteux en énergie.

De la séquence au repliement

La structure primaire d'une enzyme protéique est sa séquence d'acides aminés. Les structures secondaire, tertiaire et éventuellement quaternaire décrivent ensuite son repliement dans l'espace. Ce repliement est maintenu par des liaisons hydrogène, des interactions ioniques, des interactions hydrophobes et parfois des ponts disulfure.

La conséquence est directe. Toute atteinte à ce repliement supprime l'activité, même si la séquence d'acides aminés reste intacte. C'est ce que l'on appelle la dénaturation. La fonction enzymatique est donc une propriété de la forme, pas seulement de la composition.

Site de fixation et site catalytique

Le site actif est une petite région de la surface de l'enzyme, souvent une cavité. Il rassemble des acides aminés qui peuvent être très éloignés les uns des autres dans la séquence primaire. C'est le repliement qui les rapproche. On y distingue classiquement deux fonctions complémentaires.

Le site de fixation, ou site de liaison, assure la reconnaissance du substrat et son maintien en position. Le site catalytique porte les résidus qui réalisent la transformation chimique. Les deux se recouvrent partiellement dans la plupart des enzymes. Cette distinction fonctionnelle reste un outil de raisonnement très utile en colle.

Clé-serrure, ajustement induit et double spécificité

Deux modèles successifs

Le modèle de la clé et de la serrure a été proposé par Emil Fischer à la fin du XIXᵉ siècle. Il décrit un site actif rigide, dont la forme est déjà complémentaire de celle du substrat. Seul un substrat de géométrie adaptée peut y entrer. Ce modèle rend bien compte de la spécificité, mais pas de tout.

Le modèle de l'ajustement induit a été proposé par Daniel Koshland en 1958. Le site actif y est flexible. L'arrivée du substrat provoque un changement de conformation de l'enzyme, qui resserre le site autour de lui. La complémentarité devient optimale seulement après la fixation.

Pourquoi le second a remplacé le premier

Plusieurs observations expliquent cette évolution. Les structures obtenues par diffraction des rayons X montrent des différences de conformation entre enzyme libre et enzyme liée. Certaines enzymes acceptent des substrats proches avec des vitesses différentes, ce qu'une serrure rigide expliquerait mal. La catalyse elle-même suppose une déformation du substrat vers l'état de transition.

Le modèle de l'ajustement induit intègre ces faits et sert aujourd'hui de cadre de référence. Le modèle clé-serrure reste une première approche commode, et les deux sont attendus au lycée comme en prépa.

Spécificité de substrat et spécificité de réaction

La spécificité enzymatique est double, et la question tombe très régulièrement. La spécificité de substrat signifie qu'une enzyme donnée ne reconnaît qu'un substrat ou une famille restreinte de substrats. L'amylase hydrolyse l'amidon, pas les protéines. Cette sélectivité découle de la géométrie et de la chimie du site de fixation.

La spécificité de réaction signifie qu'une enzyme ne catalyse qu'un seul type de transformation. Un même substrat peut être pris en charge par plusieurs enzymes qui en font des choses différentes. Le glucose peut être phosphorylé par une hexokinase ou oxydé par une glucose oxydase. C'est la nature du site catalytique qui fixe la réaction réalisée.

La cinétique de Michaelis-Menten

Le schéma réactionnel et le complexe ES

Le modèle repose sur un schéma en deux étapes. L'enzyme E et le substrat S s'associent de façon réversible en un complexe ES. Ce complexe se dissocie ensuite en libérant le produit P et l'enzyme régénérée.

E + S ⇌ ES ⇒ E + P

Les constantes de vitesse sont k₁ pour la formation de ES, k₋₁ pour sa dissociation en E et S, et k₂ pour sa transformation en E et P. Elles s'expriment en s⁻¹ ou en L·mol⁻¹·s⁻¹ selon l'ordre de l'étape. Leonor Michaelis et Maud Menten ont publié ce traitement en 1913. George Briggs et John Haldane l'ont reformulé en 1925 avec l'hypothèse de l'état quasi stationnaire, plus générale.

L'équation et la vitesse initiale

On travaille toujours en vitesse initiale, notée vᵢ. C'est la pente de la tangente à l'origine de la courbe donnant la quantité de produit en fonction du temps. Ce choix évite deux artefacts, l'épuisement du substrat et la réaction inverse à partir du produit.

vᵢ = (Vmax × [S]) / (Km + [S])

Ici vᵢ est la vitesse initiale en mol·L⁻¹·s⁻¹, Vmax la vitesse maximale dans la même unité, [S] la concentration en substrat en mol·L⁻¹, et Km la constante de Michaelis en mol·L⁻¹. La courbe correspondante est une hyperbole. Elle croît d'abord presque linéairement, puis s'infléchit, puis tend vers un palier.

Vmax, Km et l'interprétation du Km

Vmax est atteinte quand toutes les enzymes sont saturées en substrat. Elle est proportionnelle à la concentration en enzyme, et elle correspond à Vmax = k₂ × [E]ₜ, où [E]ₜ est la concentration totale en enzyme. La constante de vitesse k₂ est aussi appelée constante catalytique, notée kcat.

Km est la concentration en substrat pour laquelle vᵢ = Vmax / 2. Vérifie-le en remplaçant [S] par Km dans l'équation. Un Km faible signifie que la demi-saturation est obtenue avec peu de substrat, donc une forte affinité apparente de l'enzyme pour son substrat. Un Km élevé traduit à l'inverse une faible affinité apparente.

La représentation de Lineweaver-Burk

L'hyperbole se lit mal, car le palier n'est jamais atteint expérimentalement. Hans Lineweaver et Dean Burk ont proposé en 1934 une linéarisation, obtenue en prenant l'inverse des deux membres.

1/vᵢ = (Km / Vmax) × (1/[S]) + 1/Vmax

On trace donc 1/vᵢ en fonction de 1/[S]. La droite obtenue a pour pente Km / Vmax, pour ordonnée à l'origine 1/Vmax, et pour abscisse à l'origine −1/Km. Ces trois lectures donnent accès aux deux paramètres. D'autres linéarisations existent, comme celles d'Eadie-Hofstee et de Hanes-Woolf.

Méthode : déterminer Km et Vmax sur un exemple traité

L'énoncé et les données

On mesure la vitesse initiale d'hydrolyse d'un substrat par une enzyme, à température et pH constants, pour six concentrations en substrat. Les vitesses sont exprimées en µmol·L⁻¹·min⁻¹, les concentrations en mmol·L⁻¹. Objectif : déterminer Vmax et Km.

Les étapes du calcul

Première étape, calculer les inverses. Ils figurent dans les deux dernières colonnes du tableau. Deuxième étape, vérifier l'alignement des points en représentation de Lineweaver-Burk. Les six couples se placent bien sur une droite, ce qui valide le modèle michaélien pour ce jeu de données.

Troisième étape, calculer la pente entre deux points extrêmes. La pente vaut (0,0500 − 0,0110) / (2,000 − 0,050), soit 0,0390 / 1,950, soit 0,0200 min. Quatrième étape, calculer l'ordonnée à l'origine. On écrit 0,0110 − 0,0200 × 0,050, ce qui donne 0,0100 L·min·µmol⁻¹.

Cinquième étape, remonter aux paramètres. L'ordonnée à l'origine vaut 1/Vmax, donc Vmax = 1 / 0,0100 = 100 µmol·L⁻¹·min⁻¹. La pente vaut Km / Vmax, donc Km = 0,0200 × 100 = 2,00 mmol·L⁻¹. Sixième étape, contrôler : pour [S] = 2,00 mmol·L⁻¹, la vitesse mesurée est 50,0, soit bien la moitié de Vmax.

Comment exploiter le résultat

Le Km de 2,00 mmol·L⁻¹ situe l'affinité apparente de cette enzyme pour ce substrat. Compare-le à la concentration physiologique du substrat pour juger si l'enzyme travaille près de la saturation.

La Vmax, elle, dépend de la quantité d'enzyme utilisée et ne caractérise donc pas l'enzyme seule. Si tu disposes de [E]ₜ, tu peux calculer kcat = Vmax / [E]ₜ, qui est une grandeur intrinsèque. Elle s'exprime en s⁻¹ et donne le nombre de molécules de substrat traitées par molécule d'enzyme et par seconde.

Température, pH et concentrations

Concentration en substrat et concentration en enzyme

Les deux ne se comportent pas de la même façon, et la confusion est classique. Augmenter [S] à quantité d'enzyme fixée augmente vᵢ jusqu'à un plateau. Ce plateau correspond à la saturation de tous les sites actifs disponibles. Au-delà, ajouter du substrat ne change plus rien à la vitesse initiale.

Augmenter [E] à concentration en substrat fixée déplace le plateau vers le haut. Vmax double si la quantité d'enzyme double, car Vmax = kcat × [E]ₜ. En revanche, Km ne change pas, puisqu'il ne dépend pas de la quantité d'enzyme. Retiens cette asymétrie, elle est souvent évaluée.

L'effet de la température

La courbe de l'activité en fonction de la température présente un maximum. Avant ce maximum, l'élévation de température augmente l'agitation moléculaire et la fréquence des rencontres efficaces entre enzyme et substrat. Après ce maximum, l'activité chute rapidement.

Cette chute s'explique par la dénaturation thermique. L'agitation rompt les liaisons faibles qui maintiennent la structure tridimensionnelle, et le site actif perd sa géométrie. La température du maximum s'appelle température optimale, et elle varie selon les enzymes.

L'effet du pH

La courbe de l'activité en fonction du pH présente également un maximum, appelé pH optimal. Le pH modifie l'état d'ionisation des chaînes latérales des acides aminés. Les résidus du site actif perdent alors leur charge utile à la fixation ou à la catalyse.

Un écart important par rapport au pH optimal provoque une dénaturation. Les pH optimaux diffèrent beaucoup d'une enzyme à l'autre, en lien avec leur compartiment d'action. Une enzyme gastrique et une enzyme intestinale ne travaillent pas dans le même milieu. Précise toujours que la dénaturation thermique et la dénaturation par le pH sont généralement irréversibles.

Inhibiteurs, cofacteurs et régulation

L'inhibition compétitive

Un inhibiteur compétitif ressemble structurellement au substrat. Il se fixe sur le site actif et occupe la place du substrat. La fixation est réversible, et substrat et inhibiteur entrent en compétition pour le même site.

La conséquence cinétique est caractéristique. Il faut davantage de substrat pour atteindre la demi-saturation, donc le Km apparent augmente. En revanche, un excès de substrat finit par l'emporter sur l'inhibiteur, et Vmax reste inchangée. En représentation de Lineweaver-Burk, les droites se coupent sur l'axe des ordonnées.

L'inhibition non compétitive

Un inhibiteur non compétitif se fixe ailleurs que sur le site actif. Il modifie la conformation de l'enzyme, qui devient moins efficace ou inactive. Le substrat n'entre pas en compétition avec lui, puisque les deux sites sont distincts.

La conséquence cinétique est différente. Une fraction des enzymes est rendue inactive, donc Vmax diminue. Les enzymes restées actives gardent leur affinité, donc le Km apparent est inchangé dans le cas non compétitif pur. En représentation de Lineweaver-Burk, les droites se coupent sur l'axe des abscisses.

Le tableau récapitulatif

Les deux premières lignes suffisent dans la grande majorité des exercices. Vérifie dans ton programme ce qui est exigible de toi.

Cofacteurs, coenzymes et régulation allostérique

Certaines enzymes ont besoin d'un partenaire non protéique pour fonctionner. Ce partenaire s'appelle cofacteur. Un cofacteur peut être un ion métallique, comme Mg²⁺ ou Zn²⁺, ou une molécule organique, appelée alors coenzyme. Le NAD⁺ et le FAD comptent parmi les coenzymes les plus souvent rencontrés.

Le vocabulaire se précise ensuite. L'enzyme privée de son cofacteur est inactive et s'appelle apoenzyme. L'ensemble fonctionnel enzyme plus cofacteur s'appelle holoenzyme. Un coenzyme faiblement lié est souvent appelé cosubstrat, un coenzyme lié de façon durable est appelé groupement prosthétique.

La régulation allostérique concerne surtout des enzymes à plusieurs sous-unités. Un effecteur se fixe sur un site allostérique, distinct du site actif, et modifie la conformation de l'enzyme. Un effecteur activateur augmente l'affinité pour le substrat, un effecteur inhibiteur la diminue. La courbe vᵢ en fonction de [S] prend alors une allure sigmoïde, et non hyperbolique.

C'est le mécanisme de la rétro-inhibition : le produit final d'une voie métabolique inhibe une enzyme située en amont. Les modèles de Monod, Wyman et Changeux, publiés en 1965, décrivent ce comportement.

Erreurs classiques, place au programme et applications

Les erreurs les plus sanctionnées

La première est d'écrire qu'une enzyme déplace l'équilibre ou rend une réaction possible. Elle accélère, elle ne décide pas du sens. La deuxième est de confondre Km et Vmax dans leur dépendance à la quantité d'enzyme. La troisième est d'oublier de travailler en vitesse initiale.

Confondre spécificité de substrat et spécificité de réaction fait aussi perdre des points faciles. Dire que le modèle clé-serrure est faux est excessif : il est incomplet.

Une dernière vigilance concerne l'affinité. Le Km mesure une affinité apparente, pas la constante de dissociation du complexe ES dans le cas général. Les deux coïncident dans la seule approximation de l'équilibre rapide.

La place de la notion au programme

Au lycée, les enzymes figurent au programme de l'enseignement de spécialité sciences de la vie et de la Terre, sous l'intitulé « Les enzymes, des biomolécules aux propriétés catalytiques ». Le niveau attendu y est celui de la définition, du site actif, de la double spécificité et des facteurs de l'activité. La cinétique quantitative n'y est pas exigée.

En classe préparatoire, la notion est développée en BCPST, où elle sert de base à toute la biochimie métabolique. Le programme de BCPST actuellement en vigueur a été publié au Bulletin officiel de l'enseignement supérieur et de la recherche du 1ᵉʳ juillet 2021. Vérifie le texte exact et son éventuelle mise à jour sur le site du ministère, car les intitulés se précisent d'une édition à l'autre.

Les concours d'entrée aux écoles d'agronomie et aux écoles vétérinaires évaluent régulièrement cette notion, à l'écrit comme à l'oral.

Les applications à connaître

Le dosage enzymatique est la première application à citer. On mesure l'activité d'une enzyme dans un échantillon biologique, et cette activité renseigne sur l'état d'un tissu. Les laboratoires d'analyses médicales utilisent ce principe en routine. Les enzymes servent aussi de réactifs pour doser un métabolite, comme le glucose.

L'industrie en fait un usage ancien et large, en agroalimentaire, en détergence, en papeterie et en traitement des textiles. La biologie moléculaire repose elle-même sur des enzymes, polymérases et enzymes de restriction en particulier.

La pharmacologie exploite directement l'inhibition. De nombreux médicaments sont des inhibiteurs enzymatiques, conçus pour bloquer une réaction précise. Comprendre la différence entre inhibition compétitive et non compétitive éclaire leur mode d'action. C'est aussi ce qui fait de cette partie du cours une matière à sujets de concours.